在生命科學研究領域，外周血單核細胞（PBMC）研究是許多重大科研項目的關鍵環節，無論是感染性疾病、自身免疫疾病，還是腫瘤免疫學的研究，PBMC 都扮演著的角色。然而，PBMC 的精確計數一直是個讓人頭疼的難題。
PBMC 體積小巧，細胞邊緣模糊不清，這使得檢測時難以精準識別；而且在樣本分離過程中，大量細胞碎片和潛在的紅細胞污染問題頻發，這些干擾因素嚴重影響自動對焦性能，進而導致細胞計數和活力測定出現誤差，讓科研結果的準確性大打折扣。
為了突破這一困境，科研設備不斷升級革新。基于熒光檢測的細胞計數儀，如 點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀，成為了提高 PBMC 計數準確性的常用選擇。但對于追求高性價比，希望僅依靠明場光學系統實現精準計數的科研工作者而言，挑戰依然存在。
點成LUNA-III™自動細胞計數儀應運而生，它創新性地融合了焦平面偏移校正技術和優化的細胞檢測算法，并配合臺盼藍染色，為 PBMC 計數難題提供了新的解決方案。那么，它在實際應用中的表現究竟如何呢？接下來，我們將通過對比 LUNA-III™和 LUNA-FX7™自動細胞計數儀在 PBMC 計數和活力測定中的表現，一探究竟。
首先采集人外周血，運用標準密度梯度離心法，借助 Histopaque – 1083（Sigma，#10831）成功分離出 PBMC 樣本。完成分離后，將富含血沉棕黃層的 PBMC 重懸于含 1% BSA 的 PBS 溶液中備用。
在系列稀釋測定環節，把 PBMC 按照 1 至 32 倍的不同稀釋因子進行梯度稀釋。同時，精心制備了一批用于活力測定的 PBMC 樣本，并分別設定理論細胞活力水平為 0%、25%、50%、75% 和 99% 。
計數和活力測定實驗使用點成LUNA-III™自動細胞計數儀，搭配LUNA™細胞計數專用載片，并啟用內置的 PBMC 計數程序（具體參數設置詳見表 1）。在樣本上機前，將細胞樣本與 0.4% 臺盼藍溶液（貨號 T13001）按照 1:1 的體積比充分混合。為了對比分析，同一批樣本也會用點成LUNA-FX7™自動細胞計數儀進行測試。
#細胞濃度檢測結果 #
使用 點成LUNA-III™和 點成LUNA-FX7™在三個不同的偏移水平（0、1 和 2）下對 PBMC 樣本進行測試，以此驗證在不同濃度和活力水平下的線性關系。
實驗數據顯示，所有偏移水平下，點成LUNA-III™測得的細胞濃度與理論細胞濃度均表現出較強的相關性，R2 值均在 0.9921 以上（見圖 1A）。這表明點成 LUNA-III™在細胞濃度檢測方面具有較高的可靠性。進一步分析發現，偏移水平 2 的測量結果與點成 LUNA-FX7™的數據接近。而且，從圖 1B 中可以直觀看到，點成LUNA-III™能夠精準識別并標記 PBMC，隨著稀釋倍數從 1 到 32 變化，檢測到的細胞數量也呈現出相應的變化趨勢。
圖 1. (A) 在不同稀釋梯度的 PBMC 樣本中，點成LUNA-III™ 細胞計數與理論細胞濃度之間的線性關系。(B) 使用點成 LUNA-III™ BF-total 模式檢測不同稀釋水平的代表性圖像。橙色圓圈標記點成 LUNA-III™ 識別出的細胞，檢測到的細胞數量從左至右逐漸增加，對應的稀釋倍數范圍為 1 至 32。BF-total：測量細胞總數的明場細胞計數模式。
#細胞活力檢測結果 #
在細胞活力測定實驗中，同樣在三個偏移水平（0、1 和 2）下進行測試，并與點成 LUNA-FX7™的活力數據進行對比分析。結果顯示，偏移水平 1 和 2 與理論活力值相關性較強（R2 = 0.9906 和 0.9987），但只有偏移水平 2 的結果與點成 LUNA-FX7™數據高度一致（見圖 2A）。偏移水平 0 與理論活力值的相關性較低（R2 = 0.9579），且測量結果與點成 LUNA-FX7™存在較大偏差。從圖 2B 的細胞活力標記示例圖中可以清晰看到，在點成 LUNA-III™系統中，偏移水平 2 對不同活力水平的活細胞與死細胞標記準確。
圖2. (A) 比較點成 LUNA-III™ 在三個偏移水平(0?1 和 2)下測得的細胞活力與點成 LUNA-FX7™ 的測量結果? (B)點成 LUNA-III™ 在偏移水平 0?1 和 2 下的細胞活力標記示例圖?紅色圓圈表示死亡細胞,綠色圓圈表示存活細胞? *點成LUNA-FX7™ BF-Viability:點成LUNA-FX7™ 使用明場成像評估細胞活力的計數模式?
盡管點成 LUNA-III™在 PBMC 計數和活力評估方面表現出色，但臺盼藍染色法本身存在顯著局限性。臺盼藍染色法無法有效區分 PBMC 與污染物，如紅細胞和細胞碎片。這就可能導致總細胞計數出現過高估算的情況，同時細胞活性評估也會不準確，因為污染物很可能被誤計為死亡細胞。
相比之下，像點成 LUNA-FX7™等基于熒光的細胞計數儀所采用的熒光染色方法，能夠選擇性地識別活細胞和死亡細胞，還能有效排除污染物干擾，從而提供更為精準的評估結果。所以，當處理可能含有紅細胞或碎片的 PBMC 樣本，且對細胞活性和總細胞計數的準確度要求較高時，強烈建議使用熒光染色方法。
點成LUNA-III™自動細胞計數儀憑借集成的焦平面偏移和的細胞檢測算法，顯著提升了 PBMC 計數和活性評估的準確性與精確度。尤其是偏移級別 2，其表現與高性能的點成 LUNA-FX7™相當，為科研工作者提供了一種經濟高效的選擇。
然而，我們必須認識到，使用臺盼藍染色法進行 PBMC 計數時，存在無法區分污染物的問題。科研人員在實際操作過程中，需要充分考慮這些局限性，根據實驗需求謹慎選擇合適的檢測方法和設備。希望未來能有更多創新技術出現，進一步完善 PBMC 計數和活力評估的解決方案，推動生命科學研究不斷向前發展。
