現代細胞計數儀采用自動化方法，在特定濃度范圍內進行細胞計數。其上限受限于在高濃度條件下準確區分細胞邊界的能力，而相機視野等因素則決定了下限。在圖像中僅包含少量可識別細胞或特征的情況下，自動對焦可能會失效，從而影響細胞計數的準確性，并導致變異系數（CV）升高。在常規細胞培養過程中，只要細胞濃度足夠，這通常不是主要問題。但當細胞樣本濃度極低時，例如在細胞治療產品制造的初始種子培養階段，對焦精確度就變得尤為關鍵。在此類情況下，確保在極低細胞濃度條件下獲得清晰的圖像是實現精準細胞計數的關鍵。
為了解決這一問題，我們開發了一種全新的自動對焦算法，采用技術準確識別圖像中的特征。本技術說明介紹了點成LUNA-FX7™軟件版本（v1.9.1及以上）的更新內容，該版本針對極低濃度樣本優化了自動對焦功能。此外，本文還展示了點成LUNA-FX7™全自動細胞計數儀的性能。
點成LUNA-FX7™系統采用基于圖像對比度的自動對焦算法，以優化聚焦性能。其自動對焦過程由粗略掃描和精細掃描兩個階段組成，確保點成LUNA-FX7™系統具備的對焦能力（圖1）。
該過程首行粗略掃描，在較寬的Z軸范圍內采集圖像，以覆蓋更大的景深范圍，并確定一個大致的焦平面。隨后，系統執行精細掃描，在更小范圍的Z軸平面上進一步調整焦點，以精準定位最準確的焦平面。該優化過程基于圖像特征，確保點成LUNA-FX7™系統實現對焦性能。
圖1：圖中顯示了LUNA-FX7系統自動對焦過程的工作流程，包括粗略掃描和精細掃描
依賴圖像對比度的自動對焦算法在目標物較少或圖像特征有限的情況下可能會遇到挑戰，從而難以準確確定合適的焦點位置。這一問題通常在粗略掃描階段較為明顯，此時系統難以識別適當的Z軸平面，進而導致后續精細掃描過程中的對焦失敗（圖2A）。
為解決這一問題，我們開發了一種全新的算法，以增強低細胞濃度或圖像特征較少情況下的特征識別能力（圖2B）。這種改進算法顯著提升了自動對焦過程的準確性和可靠性，在具有挑戰性的場景下提供更加精準、穩定的對焦結果。
不同算法在對焦性能上的對比
(A) 算法1未能找到正確的焦點，導致圖像模糊，清晰度較差。
(B) 算法2成功識別出合適的焦點位置，呈現出清洗銳利的圖像。
為了驗證并展示新開發的自動對焦算法的有效性，我們使用相同的樣本對不同版本的點成LUNA-FX7™軟件進行了對比實驗，結果證實該自動對焦算法的性能得到了顯著提升。這一重要改進得益于綜合優化策略的實施，有效增強了目標檢測的靈敏度，從而在所有視野范圍內實現更加精準和穩定的對焦位置（圖3）。
升級后的算法即使在圖像中目標物數量極少的復雜場景下，依然能夠精準定位焦點。在每幅圖像目標物少于5個的極低細胞濃度條件下，算法仍能穩定提供準確的對焦結果，充分體現了其的可靠性和適應性。
U937細胞被稀釋至2.54 × 10? 個/mL的濃度，使每幅圖像中的目標物數量少于5個。完整的12個視野（FOVs）展示如下。算法2能夠有效檢測并識別目標物（A），而算法1未能實現理想的對焦效果（B）。
點成LUNA-FX7™系統在極低細胞濃度條件下依然能夠實現高精度細胞計數。我們優化的自動對焦算法采用綜合增強策略，有效提高了目標檢測的靈敏度，使對焦性能顯著提升。即使在目標物或圖像特征有限的情況下，該算法仍能精準識別焦點位置。
這些技術升級使LUNA-FX7™系統成為復雜環境下可靠且高效的細胞計數解決方案。全新自動對焦算法已應用于點成LUNA-FX7™軟件版本1.9.1及以上。
