二氧化碳培養箱不像其他的如電熱恒溫培養箱，通電后就可以使用了，它要連接CO2鋼瓶后接通CO2氣體才能使用，那么如何連接鋼瓶呢？
首先在鋼瓶上面連接減壓閥（用培養箱專用閥門），再用軟管連接到二氧化碳培養箱的CO2氣體進口，軟管兩端用專用卡子固定好，鋼瓶閥門開之前，必須確保減壓閥關閉。鋼瓶閥門打開之后，再開減壓閥的小閥門，調節好壓力，具體的要控制壓力要設置在合理的壓力范圍內。
二氧化碳培養箱一般使用的壓力都不會很高，培養箱都很嬌貴的，所以一定要先調好減壓閥出口的壓力后再連接二氧化碳培養箱。
二氧化碳減壓閥裝在鋼瓶上面后，逆時針打開鋼瓶總開關，減壓閥右側表顯示鋼瓶內壓力，觀察高壓表讀數，記錄高壓瓶內中的二氧化碳壓力，壓力很低表示二氧化碳量少，需重新充入二氧化碳，壓力正常后，將減壓閥出廠配置的調節手輪插入減壓閥正面凸出凹洞處，順時針緩慢轉動減壓閥調節螺桿，使其壓縮主彈簧將活門打開，減壓閥左側表顯示出氣壓力，這樣進口的高壓氣體由高壓室經節流減壓后進入低壓室，并經出口通往CO2培養箱。
一般情況下，二氧化碳培養箱需要的壓力在0.03Mpa – 0.06Mpa范圍內，也有用到0.1Mpa的，需要根據實際情況而定。仔細檢查連接部位是否漏氣，將肥皂液涂到連接處進行檢查，如有氣泡則調節連接，確認不漏氣后進行實驗。使用完后，先順時針關閉鋼瓶總開關，再逆時針旋松減壓閥。
