雙抗體夾心法是檢測抗原zui常用的方法，但要注意的是在一步法（待測抗原與酶標抗體一起加入反應）測定中，當標本中受檢抗原的含量很高時，過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體結合，而不再形成“夾心復合物”出現鉤狀效應，甚至可不顯色而出現假陰性結果。因此在使用一步法試劑測定標本中含量可異常增高的物質（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）時，應注意可測范圍的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
雙抗體夾心法測抗原的另一注意點是類風濕因子（RF）的干擾。RF是一種自身抗體，多為IgM型，能和多種動物IgG的Fc段結合。用作雙抗體夾心法檢測的血清標本中如含有RF，它可充當抗原成份，同時與固相抗體和酶標抗體結合，表現出假陽性反應。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原，但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原，因其不能形成兩位點夾心。
雙抗體夾心法的簡要操作步驟為：
1）先加入抗體，使抗體固定結合于載體表面；
2）再加樣品，使目標檢測抗原形成抗原-抗體復合物；
3）加酶標抗抗體（第二種動物抗抗原的酶標抗體）；
4）加入酶促反應底物，發生顯色反應，顯色的深淺與待測抗原的量成正比。
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