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底物化學發(fā)光ECL是Western blotzui常用的顯色方法之一，其原理是辣根過氧化物酶在H2O2的作用下，氧化化學發(fā)光物魯米諾（Lumino）并發(fā)光，在化學增強劑存在下光強度可以增大1000倍，通過在照相底片上感光就可以檢測辣根過氧化物酶的存在。
Fig：ECL發(fā)光檢測原理示意圖
ECL法具有操作簡單，靈敏度高，線性范圍廣等特點，現(xiàn)將該方法使用中zui常出現(xiàn)的問題以及解決方法匯總如下：
| 現(xiàn)象 | 原因 | 解決辦法 |
| 信號弱或無 | HRP過高引起底物迅速耗竭 | 稀釋一抗/二抗 |
| 抗體-抗原系統(tǒng)敏感性過低 | 提高抗體濃度/蛋白上樣量 | |
| 轉膜不充分/過轉 | 優(yōu)化轉膜條件 | |
| HRP或底物活性降低 | 測試活性或選用敏感底物 | |
| 高背景 | HRP過高(背景較高) | 稀釋一抗/二抗 |
| 封閉時間不足 | 延長封閉時間4度過夜 | |
| 抗體與封閉液有交叉 | 更換封閉液(如3% BSA的TBST) | |
| TBST洗脫不足 | 增加洗脫時間、次數(shù)、用量 | |
| 曝光時間過長 | 降低曝光時間 | |
| 抗原-抗體濃度過高 | 降低抗體濃度或蛋白上樣量 | |
| 條帶內(nèi)無顯影的白點 | 轉膜不良（如有氣泡在膠-膜之間) | 精細操作 |
| 膜平衡不均/油脂污染 | 按說明書平衡膜/戴手套用平頭鑷子持膜 | |
| 膜與X光片間有氣泡 | 顯影前去除氣泡 | |
| 非特異性條帶 | 抗體交叉反應 | 稀釋一抗/二抗 |
| 散在小圓斑 | 封閉液有雜質(zhì)顆粒 | 靜置牛奶使大顆粒沉淀，僅用上層 |
| 反影(白色條帶,黑色背景) | HRP過高(背景較高) | 稀釋一抗/二抗 |
| 顯影后膜上條帶處變?yōu)辄S色 | HRP過高(敏感性太高) | 稀釋一抗/二抗 |
⇒ 高靈敏度的非放射性檢測系統(tǒng)：可檢測低至100fg～1pg的抗原，適用于痕量抗原的檢測。
⇒ 高分辨率：本底極低，即使長時間曝光，背景仍然極低，遠遠優(yōu)于國產(chǎn)與進口同類產(chǎn)品。
⇒ 半衰期長：信號衰減慢，12個小時以上仍可感光X光膠片。
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