制備DLIN-MC3脂質納米顆粒
實驗目的：
分別以DLIN-MC3為陽離子主要脂質，參照文獻方法制備包載 mRNA 的 LNP。
實驗原理：
DLIN-MC3是可解離脂質，在酸性條件下可質子化形成陽離子脂質，通過靜電作用于帶負電的 mRNA 結合，形成載有 mRNA 的脂質納米顆粒(lipid nanoparticles, LNPs) 。常見的制備方法有薄膜-水化法、 溶劑注 入法、 高壓均質法和微流控法等方法， 在本實驗中采用微流控法， 讓脂質溶液與和 mRNA 溶液在微混合器中充 分、迅速的混合，形成粒徑均一的 LNP 。由于脂質溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性緩沖液中，因此需要透 析去除殘余的乙醇并換液至 PBS。
實驗材料：
DLIN-MC3 、DSPC 、DMG-PEG2000 、冰醋酸、三水*
實驗步驟：
1 、 配置脂質乙醇溶液：
a) LNP 的成分與分子量見下表：
名稱 | 摩爾比% | 分子量 | 質量 |
DLIN-MC3 | 50 | 642.09 | 130mg |
DSPC | 10 | 790.2 | 33mg |
PEG-2000 | 1.5 | 2509.2 | 16mg |
CHO | 38.5 | 386.654 | 62mg |
無水乙醇（AR) | 100ml | ||
百分比來源于前期研究，并不一定與 onpattro 和 mRNA-1273 相同。
b)每種成分別配置三個濃度： 8 mM（約5 mg/ml） 、12 mM（約7.5 mg/ml） 和16 mM（約10 mg/ml） 。
名稱 | 重量或體積 |
冰醋酸 | 8ml |
三水* | 3.2g |
純化水 | 1000ml |
2、 計算 mRNA 濃度：
a) 根據 N/P=6，FRR=3 計算所需 RNA 濃度。
b) RNA 的堿基的平均分子量為340，每個堿基攜帶1 個磷酸， 因此RNA 中的含磷量為3.1 nmol/ μg.
c) 計算氮磷比時僅計算主要脂質中的氮原子數，因此每摩爾混合脂質中含有 0.5 摩爾 N。
脂質濃度(mM) | 8 | 12 | 16 |
N/P | 6 | 6 | 6 |
FRR | 3 | 3 | 3 |
RNA 濃度(μg/ul) | 0.072 | 0.108 | 0.143 |
3 、 配置 mRNA-醋酸緩沖液：
稱取3.2g三水*，8ml冰醋酸，定容于1000ml 。加入相應梯度的mRNA
4 、 微流控混合：
a. 將脂質- 乙醇溶液過 0.22 μm 疏水聚四氟乙烯膜，mRNA-檸檬酸緩沖液過 0.22 μm 親水聚四氟 乙烯膜，過膜后裝入微量注射器中。
b. 以FRR=3 ，磷脂和緩沖液以0 . 2ml/min和0 .6ml/min ，通過nexstarnano1芯片，混合。
5 、 透析與儲存：
a) 制備后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入 14 ml PBS 在搖床上透析，2 小時后換液，直至 18 小時后透析結束。
b) 保存于 4℃待用。
實驗名稱： LNP 包封率測定
實驗目的：
對制備的 LNP 包封 mRNA 的效果進行測定
實驗原理：
Quant-iT™RiboGreen®RNA 試劑是一種超靈敏的熒光核酸染色劑，可檢測溶液中 1-200 ng 的核酸，這種 核酸染料無法透過 LNP，因此只有游離的未被 LNP 包載的核酸可以被結合。Triton-100 作為一種表面活性劑 常被用做破乳劑，使用 1%的 Triton-100 處理獲得的 LNP-mRNA 可以使包載的核酸釋放，得到總核酸量。通 過計算破乳前后核酸量的差異得到載藥量，再除以總核酸量即可得到包封率，即：
包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量） /破乳后定量
實驗材料：
Quant-iT ™ RiboGreen ™ （SIGMA-ALDRICH ，T8787-100ML）、
LNP-mRNA
RNA 檢 測 試 劑 盒 （ Thermo Fisher ， R11490 ）、 Triton ™ X-100
DEPC 水、CellCarrier-96 Ultra Microplates （ PerkinElmer ，6055308）、
實驗步驟：
1. LNP 制備：
見 LNP 制備流程。
2. 試劑準備（詳細參見說明書）：
將 20xTE 用 DEPC 水稀釋至 1x；
用稀釋好的 1XTE 稀釋試劑盒中的標準品，稀釋成 2 μg/mL 及 100 ng/mL 兩種終濃度；
用 1xTE 稀釋試劑盒中的 QuantiT™ RiboGreen® Reagen ，稀釋成 200 倍及 2000 倍兩種終濃度； 按照下表在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入以下試劑，做復孔：
High range
3. LNP 破乳
將 Triton-100 用 1xTE 稀釋到 2% ，取 100 μl 加入 CellCarrier-96 Ultra Microplates ，加入 1 μl 制備好的
LNP ，處理 5 分鐘，加入 100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
4. LNP 游離核酸測定
在 CellCarrier-96 Ultra Microplates 中加入 100ul1xTE，取 1μl 制備好的 LNP 加進去，混勻，加入 100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
5. 讀板
使用 SPARK 讀取熒光強度，激發光設置為 480 nm ，發射光為 520 nm
6. 數據處理
1） 標曲制備
2) 樣品定量
載藥量=破乳后讀值-破乳前讀值 包封率（%）=載藥量/破乳后讀值
